中華人民共和國成立後，任劉少奇秘書，劉少奇出任國家主席後多次隨劉到外國出訪。外國媒體多以「第一夫人」稱呼王光美，引起毛澤東夫人江青不滿，江青認為自己作為中共中央主席的夫人，才是理所當然的第一夫人，[3]這為以後文化大革命批鬥劉少奇夫婦兩人埋下伏線。[4]四清運動前期，王光美帶工作隊到河北省撫寧縣盧王莊公社桃園大隊搞試點，總結出「桃園經驗」[5]。

1967年1月6日，王光美接到蒯大富電話，說她正在讀中學的女兒劉平平在路上被汽車軋斷了腿，要動手術，要她到醫院來簽字[6]。她一到醫院，便被清華大學造反派扣押，此即所謂「智擒王光美」事件[7]。王光美在文化大革命中受劉少奇之冤波及而受批鬥，被冠稱為「梅花黨的黨魁」，並以罪名「美國特務」在1967年7月中旬起在秦城監獄入獄達十二年。至1972年，王光美入獄後，第一次見到孩子之前幾小時才得知劉少奇已經被迫害死亡。文革中，林彪、江青等力主處以王光美死刑，但毛澤東批示「刀下留人」，1979年王光美才重獲自由[8]。

1978年3月當選第五屆全國政協委員，同年12月，恢復了其人身自由及其地位。1979年，任中國社會科學院外事局局長。1984年起，任輔仁大學北京校友會會長。1989年，王光美罹患乳腺癌，前後歷經兩次大手術。之後尚因腫瘤轉移，再次接受大手術。1995年1月，任中國人口福利基金會發起的扶貧計劃「幸福工程」組織委員會主任，開始了幫扶中國貧困母親的艱難之旅。1996年秋天，她拿出母親作為紀念留下的古董拍賣，所得56.6萬元人民幣全部捐獻給「幸福工程」[9]。1998年10月獲第三屆「中國人口獎」榮譽獎[10]。

2000年左右，又接受一次手術，身體漸變衰弱。2005年，辭去計畫主任一職。2006年10月13日凌晨3時42分，在北京醫院因肺部感染引起心臟衰竭病逝；告別式於10月21日在北京八寶山革命公墓舉行[11]。逝世4日後被中國扶貧基金會選為第二屆中國「消除貧困獎」成就獎得獎人。臺北輔仁大學10月24日於校內野聲樓舉行了追思會。